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NGS測序之文庫構(gòu)建

更新時(shí)間:2024-04-08點(diǎn)擊次數(shù):2524

由于二代測序讀長的限制,不可能一下將一個(gè)很長的基因序列測通,因此需要先將長基因序列隨機(jī)片段化成小片段,這樣的話,這些片段就可以覆蓋整個(gè)基因組。所以需要構(gòu)建文庫。

一、文庫構(gòu)建的步驟

文庫構(gòu)建大致步驟類似,但是各有各自du特的點(diǎn),例如,RNAseqmiRNAlncRNA,mRNA方法各有差異,具體方法以后有機(jī)會(huì)再補(bǔ)充。這里以IlluminaPE文庫為例,其流程圖如下圖。

6-2.png


二、文庫構(gòu)建詳細(xì)步驟

1DNA片段化 (Fragment DNA

使用超聲、酶或者加熱的方式將DNA樣品打碎成小片段,一般在300 ~ 800bp之間除非有特殊要求。

2末端修復(fù)(End Repair

補(bǔ)平片段化時(shí)導(dǎo)致的不平末端。

33' 末端加“A" A-tailing

3‘ 末端加A,轉(zhuǎn)換為粘性末端,與adapter 互補(bǔ)配對,因?yàn)?/span>adapter 3‘端有一個(gè)突出的T。

4)接頭連接( ligation adaptor

這一步有兩種不同的添加策略如下圖。

6-3.png

左邊的圖是直接在fragment DNA的兩端直接加上full Y-adapter, adapter中已經(jīng)包括了和P5/P7 oligo互補(bǔ)的序列, index, 以及Read1/Read2的測序引物。

右邊的圖是先在fragment DNA的兩端加上PE adapter, 然后再引入和P5/P7 oligo互補(bǔ)配對的序列以及index序列,分兩步:

A. PE adapter添加利用堿基互補(bǔ)配對的原則,加上PE adapter。PE adpater中一部分是建庫PCR富集時(shí)候需要用的引物序列,另一部分是測序時(shí)需要用的引物。

B.PCR 添加 index,P5,P7

Index也稱barcode,用來區(qū)分不同樣本的文庫,因?yàn)闇y序儀一個(gè)lane產(chǎn)生數(shù)據(jù)量若干Gb,為了最da化利用測序儀,一次上機(jī)常會(huì)進(jìn)行多個(gè)樣本文庫混合測序,在后續(xù)分析時(shí),Index用來區(qū)分?jǐn)?shù)據(jù)是來自哪個(gè)樣本。

      PCR富集目的片段

進(jìn)行PCR擴(kuò)增,循環(huán)數(shù)與投入的DNA量有關(guān),使得文庫達(dá)到上機(jī)濃度。

擴(kuò)增文庫大小質(zhì)檢

使用Agilent 2100對文庫的insert size進(jìn)行檢測。

文庫濃度定量

Qubit3.0 進(jìn)行初步定量 Q-PCR對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量,至此文庫構(gòu)建結(jié)束。

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